免疫熒光技術(shù)-直接法

1. 標本經(jīng)固定后，PBS洗滌3×3 分鐘；

2. 加熒光素標記的抗體，濕盒內37 ℃孵育50 分鐘；

3. PBS洗滌3×3 分鐘；

4. 0.1 %伊文氏蘭復染；

5. PBS洗3 次，蒸餾水洗2 次，每次3 分鐘，以除去NaCl結晶；

6. 緩沖甘油封片，鏡檢。

對實(shí)驗結果的觀(guān)察、判斷與分析是影響實(shí)驗結果的重要環(huán)節，判斷結果的好與壞、真與假需注意以下幾點(diǎn)。

1、必須設立對照染色（陰性或陽(yáng)性對照），沒(méi)有對照染色的結果是沒(méi)有說(shuō)服力的。

2、正確判斷真陰性和假陽(yáng)性。

(1)了解抗原表達是否在特定部位，如VP陽(yáng)性出現在神經(jīng)元胞漿，Fos標記細胞胞核，若陽(yáng)性產(chǎn)物不在抗原所在部位，通常認為是假陽(yáng)性。

(2)對陰性結果，不能視為抗原不表達，應該參考他人的結果或進(jìn)行相應的對照實(shí)驗，尋找原因，判斷是否為真陰性。

(3)在切片破損區域，出血壞死灶或刀痕等位置容易出現陽(yáng)性表達，應鑒別分析。

(4)染色時(shí)間的掌控很關(guān)鍵，可以避免非特異著(zhù)色或假陽(yáng)性細胞。

3.所有免疫組化操作步驟均能影響其結果，判斷的關(guān)鍵在于以下幾點(diǎn)。

(1)組織切片完整，結構清晰，說(shuō)明灌注取材、脫水、制片過(guò)程中沒(méi)有問(wèn)題。

(2)切片著(zhù)色鮮艷，說(shuō)明抗體種屬之間配伍沒(méi)有錯誤，染色步驟正常。

(3)陽(yáng)性與陰性結果部位明確，說(shuō)明所用抗體的特異性強。

4.切片例數、陽(yáng)性產(chǎn)物數量統計、分析應符合統計學(xué)要求。