大鼠肝星狀細胞原代培養實(shí)驗——胰酶消化法

一、實(shí)驗材料準備

1.  動(dòng)物：雄性SD大鼠(體重250-450 g)。
 

2.   試劑：戊巴（匕匕）妥鈉，小牛血清(或胎牛血清，則更好)，DMEM，酶消化液I、Ⅱ(以HBSS配)，18% Nycodenz(以GBSS配)，D-Hanks' 液(KCl 0.4 g/L，KH2PO4 0.06 g/L，NaCl 8.0 g/L，NaHCO3 0.35 g/L，Na2HPO4·7H2O 0.06 g/L或Na2HPO4 0.053 g/L，可加酚紅 0.02 g/L)，HBSS，臺盼蘭等。
 

3.  器械：手術(shù)器械，200目尼龍網(wǎng)，相差顯微鏡，熒光顯微鏡。
 

二、原代培養方法
 

1.  大鼠腹腔麻醉后在超凈臺上剖腹，進(jìn)行門(mén)靜脈插管，以D-Hanks'液灌注，同時(shí)剪開(kāi)下腔靜脈，沖掉血液后，改灌以100 ml酶消化液I(0.05% IV型膠原酶)。

2.  待肝臟變軟后，離體肝臟并剪碎，繼續以酶消化液II(含20 U/ml DNase I的0.05% IV型膠原酶)消化15 min，尼龍網(wǎng)過(guò)濾后以450 g 離心5 min(4℃，下同)。

3.  以HBSS重懸沉淀至10 ml，再混以20 ml Nycodenz液，分置于離心管中，并分別覆以2-3 ml HBSS，1450 g離心16 min后取界面細胞。

4.  以HBSS重懸后再次離心收集細胞，以DMEM重懸后進(jìn)行細胞計數，并判斷存活率和產(chǎn)量，最后按照常規方法接種(105細胞/cm2)，次日換液，以后每2-3天換液一次。
 

三、傳代方法

棄去培液后以D-Hanks'液洗兩次，加0.125%胰酶(原代最好加0.05% EDTA)消化，鏡下觀(guān)察細胞突起回縮(2-5 min左右)，以*培液(DMEM+10% NBS)終止反應(若不用EDTA，可以不需離心)，充分吹打后以1:2-1:3接種，然后繼續培養(5%CO2，37℃)。
 

四、 結果

接種次日，光鏡下可見(jiàn)細胞呈星芒狀，胞質(zhì)內有脂滴，熒光鏡下328 nm處見(jiàn)自發(fā)熒光。附上發(fā)表于Biochem Biophys Res Commun 2004年文章的照片(圖1)。