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哺乳動(dòng)物細胞基因穩定轉染的實(shí)驗

發(fā)布時(shí)間： 2021-12-14　　點(diǎn)擊次數： 745次

材料與儀器

哺乳動(dòng)物細胞
*培養液
培養箱離心管

步驟

1. 確定所要轉染的細胞系能呈獨立集落生長(cháng)。對于貼壁細胞，在10 cm 組織培養培養皿中接種約100個(gè)細胞，培養10~12天，毎4天換液1次。亞甲藍染色后對成活的細胞集落進(jìn)行計數。

2. 確定母代細胞的選擇條件：將一培養皿上生長(cháng)匯片的細胞按不小于1：15的比例分傳于含有不同藥物濃度的培養液中。培養10天。用合適的選擇培養液每4天換液1次，并檢查活細胞。

3. 確定轉染母代細胞的*的方法?？蛇x用磷酸鈣或電穿孔方法。對于磷酸鈣轉染，在加DNA的前1天，將母代細胞按1：15分傳中*培養液中。

4. 用目的基因轉染母代細胞，含目的基因的質(zhì)粒與含標記基因的質(zhì)粒的摩爾比例不小于5：1。用擔體DNA替代含有目的基因的質(zhì)粒作為對照，分別進(jìn)行幾次轉染。

5. 在無(wú)選擇條件下讓細胞倍增2次。將細胞按1：15分傳于選擇培養液中。

6. 在選擇培養液中接種5個(gè)以上培養皿，以得到盡可能多的能挑取和擴增成細胞系的細胞集落數，每4天用選擇培養液換液，培養10~12天，將培養皿對著(zhù)光成一角度觀(guān)察其中的細胞克隆，其中的一只培養皿直可進(jìn)行染色以便于計算細胞集落數。挑取大的、生長(cháng)良好的細胞集落。

注意事項

如果用5：1的比例，沒(méi)有必要在轉染前將透擇標記基因與目的基因連接起來(lái)：如果選擇需要用大量的選擇性質(zhì)粒，有時(shí)無(wú)態(tài)保證5：1比例，故要將選擇標記基因及所要研究的目的基因構建在同一個(gè)質(zhì)粒中。如果用含有所研究的基因進(jìn)行轉染沒(méi)有形成克隆，而在含有的對照中卻可產(chǎn)生究隆，則所研究的基因能有細胞毒性。

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