氨基酸代謝標記實(shí)驗

材料與儀器

37℃ 細胞懸液 [35S]標記L-甲硫氨酸（>800 Ci／mmol)／[35S]標記蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物
PBS(冷凍) 37℃ 脈沖標記培養基
配有液體同位素垃圾閥門(mén)的真空吸氣器

步驟

1. 室溫融化 [35S] 標記甲硫氨酸，并用預熱的（37℃）脈沖標記培養基制備 0.1~0.2 mCi/ml 的工作溶液。

2. 室溫下 300 g 離心 5 min，獲得懸液中 0.5 × 107~2 × 107 細胞。用 10 ml 預熱的脈沖標記培養基洗細胞。室溫下 300 g 離心 5 min, 吸棄上清。輕柔敲打試管底部使細胞重懸并再洗一次。

3. 用預熱脈沖標記的培養基重懸細胞，使其濃度為 5 × 106/ml。在 37℃ 水浴中溫育 15 min 以去掉細胞內的甲硫氨酸。定時(shí)顛倒試管來(lái)使細胞重懸。

4. 室溫下 300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 2 ml [35S] 標記甲硫氨酸的工作溶液（見(jiàn)步驟 1）重懸細胞，轉移至干凈 15 ml 離心管中。蓋緊蓋子。在 37℃ 水浴中溫育 10~30 min, 不時(shí)輕柔顛倒試管或振蕩使細胞重懸。

5. 4℃、300 g 離心 5 min，吸棄上清。用 10 ml 冰預冷的 PBS 輕柔重懸并再次離心。

6. 可選：通過(guò)三氯乙（yi）酸（TCA）沉淀來(lái)測定標記物的摻入量（見(jiàn)輔助方案）。

7. 如果細胞沉淀不馬上使用的話(huà)，可以置于冰上幾小時(shí)或 80℃ 保存幾天。分析前冰上融化細胞沉淀。

注意事項

1. 在標記過(guò)程中，揮發(fā)性的含有[35S]標記的化合物可能會(huì )釋放，含有[35S]標記甲硫氨 酸的培養基應保存在密閉緊蓋的試管中，用前置于37°C水浴。在37°C不能超過(guò)60 min。

2. 在大多數情況下，冷凍細胞不會(huì )影響蛋白質(zhì)的生物化學(xué)特性，但是在用去污劑溶解后再凍融細胞 抽提物可引起多亞單位復合物的解離或標記蛋白質(zhì)降解。

常見(jiàn)問(wèn)題

1. 實(shí)驗材料中的細胞懸液可以選擇如 Jurkat、RBL、K562、BW5147、T 和 B 細胞雜交瘤等，要求是生長(cháng)于潮濕、37℃、5% 032溫箱中或從組織中制備（如淋巴細胞）。

2. 脈沖標記不會(huì )使培養基中的標記物*喪失，因此標記混合物可以重復使用。收集標記的培養 基，小心地用0.45 μm的濾器濾過(guò)。細胞標記前后通過(guò)閃爍記數標記混合物來(lái)估計未摻人放射活 性的百分比。-20°C冷凍條件下標記的混合物可以保存2個(gè)月。