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放射自顯影術(shù)實(shí)驗

發(fā)布時(shí)間： 2022-12-06　　點(diǎn)擊次數： 982次

簡(jiǎn)介

培養細胞的放射自顯影術(shù)射性既可以研究細胞本身的物質(zhì)代謝之外，還可用來(lái)分析細胞的動(dòng)態(tài)活動(dòng)、細胞周期等。

原理

培養細胞放射自顯影術(shù)原理是將培養細胞的放射性同位素釋放射線(xiàn)，作用于感光乳膠，使感光乳膠中的鹵化銀感光形成潛影，再經(jīng)顯影劑作用，感光的鹵化銀還原成黑色的銀顆粒，未感光的銀鹽則經(jīng)定影去除，在乳膠中留下清楚明確的圖像。

材料與儀器

器材：
① 培養的細胞
② 細胞傳代培養的設備
③ 直徑 3.5 cm 塑料培養皿（或 50 ml 培養瓶）
④ 2.2 cm x 2.2 cm 蓋片（或自裁成 6 mm x 40 mm，放入培養瓶）
⑤ 曝光鉛盒或黑色塑料盒
⑥ 電磁攪拌器
⑦ 恒溫臺（可調節溫度以烘干乳膠）
⑧ 載片
⑨ 中性樹(shù)膠
⑩ 暗室及相應設備
試劑：
① 同位素標記物（如 3 H-TdR、3 H-UdR 等）
② 液體乳膠（常用核 IN 號）
③ 顯影液
④ 定影液
⑤ 甲醇
⑥ 吉姆薩染液

步驟

培養細胞放射自顯影術(shù)的基本過(guò)程可分為以下幾步:
（1）同位素標記物與細胞的結合
A. 用培養基稀釋同位素標記物，培養細胞放射自顯術(shù)常用濃度為 0.1～2 μ Ci/ml。如采用 3 H-TdR，建議濃度為 0.5～1 μ Ci/ml。
B. 棄去培養細胞的培養基，用 Hanks 緩沖液洗涮 1 次，加入上述含有同位素的培養基。一般 50 ml 培養瓶加 3 ml 培養液。
C. 將上述細胞置 37 ℃ 恒溫箱溫育一定時(shí)期（溫育時(shí)間按實(shí)驗要求和同位素種類(lèi)及濃度等因素而定，一般如 3 H-TdR 在 1 μ Ci/ml 濃度下，溫育 1～4 h 即可），然后棄去培養液，用 Hanks 液涮洗 3 次，以去除未摻入細胞內的放射性物質(zhì)。
（2）固定
按常規細胞學(xué)方法進(jìn)行，但應避免使用含有重金屬離子的固定液，以免增加本底顆粒數目。建議用純甲醇固定，時(shí)間 30 min 以上。
（3）涂布乳膠
A. 乳膠的準備于暗室中紅光下，將核 IN 乳膠從不透光的容器中取出，置于 10 ml 小燒杯中，將小燒杯置于電磁攪拌器上，放入潔凈鐵芯小玻棒 1 枚，開(kāi)啟電磁攪拌器，使乳膠化，為稀釋起見(jiàn)，可加入適量附加液或三蒸水，攪拌數分鐘使乳膠與附加液充分混合均勻。如無(wú)電磁攪拌器，可將三蒸水 40 ℃ 預熱，然后加入等量或 2/3 量的核 IN 乳膠，用干凈玻棒攪拌均勻，應避免出氣泡。
B. 將生長(cháng)有培養細胞的小蓋片條（或培養皿中的方蓋片）取出，將其一端用膠布粘于載片上（注意：使有細胞的一面朝上，此面外觀(guān)較粗糙），然后在有細胞的蓋片上滴 1 滴乳膠，用吸管將乳膠輕輕涂開(kāi)。
C. 將上述涂有乳膠的玻片直立于切片架上，使乳膠盡量成為薄層，再以低速小風(fēng)扇吹干。
D. 待乳膠干硬后（10～20 min），將片子置于預先置有干燥劑（常用硅膠或氯化鈣）的曝光盒內，用黑紙將曝光盒包嚴，注明同位素標本記號，置 4 ℃ 冰箱內，或室溫下曝光。
（4）曝光
曝光時(shí)間隨標本的放射性強度、同位素劑量和實(shí)驗要求而定。為闡明同位素在細胞和組織內的精確定位，曝光時(shí)間要短；為了顯示小量放射性同位素的定位，曝光時(shí)間宜長(cháng)。對半衰期長(cháng)的同位素，活性小的標本應相應地增加曝光時(shí)間。為選擇最佳曝光時(shí)間，可參考同類(lèi)的工作，一般應進(jìn)行試驗性曝光，以決定最佳曝光時(shí)間。3 H、C、35 S 標記物通常曝光 3～7 d 即可。
（5）顯影與定影
顯影與定影時(shí)間隨曝光時(shí)間和同位素劑量而不同，在一般照相的顯影液中，于 18～20 ℃ 時(shí)，顯影 3～5 min，然后在 1% 乙酸溶液中置 1～3 min，再轉入定影液內 30 min 左右。
（6）染色
將標本用自來(lái)水連續沖洗數分鐘（切忌水流過(guò)急、過(guò)大），再以三蒸水洗涮 1 次，晾干后用吉姆薩染色（也可用 HE 染色）。
（7）封片
染色后晾干，用中性樹(shù)膠封片，在油鏡下觀(guān)察、攝影。

注意事項

1. 涂布乳膠有各種方法，其原則是涂布要均勻一致，此外盡可能地要稀薄。
2. 從涂布乳膠開(kāi)始須在暗室內進(jìn)行，直至定影完畢方可見(jiàn)光。
3. 同位素廢棄物處理須嚴格按要求執行，不可污染環(huán)境。

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