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瓊脂中克隆培養

發(fā)布時(shí)間： 2022-12-13　　點(diǎn)擊次數： 804次

原理
溫度高時(shí)瓊脂呈液態(tài)，但在37℃ 時(shí)成凝膠狀態(tài)，細胞懸浮在溫暖的瓊脂凝膠培養基中，待瓊脂形成凝膠后進(jìn)行培養，形成散在集落，很容易分離。
材料與儀器
Noble瓊脂 Difco 胎牛血清
兩倍濃度培養基生長(cháng)培養基無(wú)菌超純水無(wú)菌錐形瓶吸管通用容器培養皿水浴三角瓶托盤(pán) 電子細胞計數儀本生煤氣噴燈
步驟
1. 在培養皿底皿側面編號或做好標記，將培養皿放在托盤(pán)中，很方便。

2. 準備含 40 % FBS 的 2× 培養基（即 Ham’SF12、RPMI1640、DMEM 或 CMRL1066。用 10×培養基配 2× 培養基，取半量所需終液量，加兩倍濃度的血清），保持 37℃。

3. 稱(chēng)取 1.2 g 瓊脂。

4. 分別在無(wú)菌錐形瓶和另一個(gè)無(wú)菌瓶中加 100 ml 無(wú)菌 UPW。將 1.2 g 瓊脂放人錐形瓶中，蓋好，煮沸 2 min 。另一種方法是，提前高溫滅菌瓊脂。但若已保存起來(lái)，使用時(shí)仍需煮沸溶解或微波爐融化備用。

5. 將煮沸過(guò)的瓊脂和有 UPW 的瓶放到 55°C 水浴中。

6. 2× 培養基和 1.2 % 瓊脂等量混合制備 0.6 % 瓊脂底層，保持 37°C 。如果需要任何的生長(cháng)因子、激素或其他添加物，應在此時(shí)添加至底層瓊脂培養基（生長(cháng)培養基，1×，用于細胞稀釋?zhuān)﹥取?br style="border: 0px solid currentcolor; box-sizing: border-box; --tw-shadow:0 0 #0000; max-width: 100%; background: none !important; font-size: 0.32rem !important; line-height: 0.48rem !important; margin: 0px !important;"/>
7. 在培養皿中加人 1 ml 0.6 % 的瓊脂培養基，晃勻，確保培養基覆蓋整個(gè)培養皿底。置于室溫定型。

8. 制備細胞懸液，計數。

9. 準備 0.3% 瓊脂培養基，保持 37°C 。此培養基可以用 37°C 的 2× 培養基、55°C 的 1.2 % 瓊脂和 55°C 的 UPW 以 2:1:1 的比例混合制備。

10. 制備以下稀釋濃度的細胞，使細胞的最大濃度為 1×105 /ml。

(a)1×105 /ml

(b)將 1×105 /ml 稀釋 3 倍成 3.3×104 /ml

(c)將 3.3×104 /ml 稀釋 3 倍成 1.1×104 /ml

(d)將 1.1×104 /ml 稀釋 3 倍成 3.7×103 /ml

11. 將四種稀釋液的濃度分別標在 4 個(gè)小玻璃瓶或試管上，從每種稀釋液中吸出 40 μl，包括 1×105 /ml 細胞液，分別放入相應容器內 37°C 加 4 ml 0.3% 瓊脂培養基，混勻，再從每個(gè)容器（通用容器，小玻璃瓶或離心管，稀釋細胞用）中吸出 3 個(gè) 1 ml 分別加在相應的三個(gè)培養皿上。最終濃度如下：

(a)1×103 /ml/皿

(b)330 /ml/皿

(c)110 /ml/皿

(d)37 /ml/皿

加細胞之前，確保上層瓊脂培養基有足夠的時(shí)間冷卻至 37°C 。

12. 待培養皿中的溶液在室溫下形成凝膠狀態(tài)。

13. 將培養皿放置在一個(gè)帶蓋的清潔塑料盒中，37°C 加濕溫箱中培養 10 天。
注意事項
準備培養基和細胞之前，先算出細胞稀釋度，在培養皿上做好標記，檢測一個(gè)細胞系的克隆形成率時(shí)，為每種稀釋度的細胞分別準備3 個(gè)培養皿。每個(gè)3. 5 cm 培養皿適宜接種的細胞數是1000、333、111和 37 個(gè)。也就是依次 3 倍的稀釋細胞懸液。如果需要加入生長(cháng)因子、激素或其他添加劑，應加在下層的 0.6 % 瓊脂中。

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