怎么使用GSIS方法檢測細胞胰島素分泌

Min6細胞是這次贈送活動(dòng)中很多客戶(hù)選擇的細胞，一共送出去有50多株，隨之而來(lái)的就是問(wèn)胰島素的檢測，很多客戶(hù)檢測出來(lái)只有低表達。

Min6細胞培養需要注意三點(diǎn)：

1.細胞易聚團，消化的時(shí)間表面上看會(huì )非常短暫，大約30秒會(huì )全部脫落，脫落后請延長(cháng)消化時(shí)間到2分鐘后，再中和，細胞后期聚團會(huì )減少。

2.活細胞運輸的時(shí)候會(huì )漂浮，請收集培養基離心，離心后重新鋪板以完-全培養基剛沒(méi)過(guò)細胞為準，完-全培養基加太多會(huì )導致細胞浮力過(guò)大，貼壁不上。

3.培養基請一定要加0.05mm的β-Mer

以下是我們檢測使用的buffer和protocol，步驟不能少，一步一步的來(lái)。

Buffer的配制：

NaCl 114mM, KCl 4.7mM, KH2PO4 1.2mM, MgSO4-7H2O 1.16mM, NaHCO3 25.5mM, CaCl2 2.5mM, HEPES 20mM, 0.2% BSA --> pH 7.2-7.5（一定要控制PH值范圍）

操作步驟：以2mM glucose 和25mM glucose 為例:

細胞鋪板每孔大約2000個(gè)細胞，鋪板前三天左右脫抗生素采用滅活血清+β-Mer培養1640+10%FBS(滅活）+0.05mm β-Mer；在96孔板中培養24小時(shí)，然后將培養基改為含2mM葡萄糖培養基過(guò)夜。

1.去除培養基，1 x PBS清洗細胞5分鐘

2.基礎緩沖液(2mM 葡萄糖) ，2小時(shí)孵育 -- > 培養

3.去除上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

4.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時(shí)孵育

5.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

6.葡萄糖刺激(2mM ) ，1小時(shí)孵育；

7.收獲上清液 -- > 1 x pbs 清洗，請注意不要觸碰底面

8.上清液取樣 -- > 1500轉，5 min，4度；

9.細胞裂解---- > 蛋白質(zhì)定量---- > 上機

以下為檢測結果：

注意點(diǎn)：

為了確保細胞分泌的胰島素混合到上清液樣本中，可以在培養期間在100-300轉的平板振蕩器上輕輕攪動(dòng)細胞。

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