要做好CCK-8實(shí)驗，這三個(gè)重要環(huán)節請注意

在做細胞基礎實(shí)驗時(shí)，必要的一步就是需要探究清楚細胞的增殖變化和毒性耐藥變化情況，為下一步實(shí)驗做準備。

我們在做CCK-8增殖和毒性實(shí)驗中常常會(huì )遇到一下幾個(gè)問(wèn)題：

1.細胞鋪板問(wèn)題 2.給CCK-8的方式問(wèn)題 3.CCK-8的反應時(shí)間問(wèn)題

首先，在進(jìn)行細胞鋪板時(shí)， 需要用血球計數板進(jìn)行細胞計數，得到細胞數量后按照所需鋪板的細胞數量進(jìn)行調整。一般96孔板鋪板數量為1*10^6/孔。

制備細胞懸液時(shí)需要反復吹打，使細胞懸液充分混勻，降低出現細胞團塊的幾率。一般96孔板，每孔加入100微升細胞懸液，從孔的9點(diǎn)鐘方向打入，加入半張板子時(shí)，需要再次將細胞吹勻，然后繼續加剩余的孔。

待全部加入完畢時(shí)，蓋上蓋子，放入培養箱。（細胞的均勻鋪被是本實(shí)驗成功的大前提）。

其次，是細胞的處理。一般給CCK-8有兩種方式：第一種是直接每孔加入10微升的CCK8原液；另一種則是配置含10%的CCK-8培養基，以換液的形式加入孔板。

第一種方式的弊端在于10微升的CCK-8量比較少，可能因沾在孔壁導致誤差的出現。

第二種方式可以避免上述情況的發(fā)生，但操作過(guò)程中仍需注意10%的CCK-8培養基需要現配現用；其次打入100微升的CCK-8時(shí)沿著(zhù)孔壁將槍頭伸入液體緩緩打出，再移出槍頭。

期間可能會(huì )產(chǎn)生小氣泡，需要用無(wú)菌針頭燒紅插入氣泡，消除氣泡。（氣泡會(huì )影響OD值，因此應該盡量消除）。

最后，就是反應時(shí)間問(wèn)題。將孔板放入培養箱培養1-4小時(shí)，引細胞種類(lèi)和數量的差異，可能形成的Formazan的量不一樣。因此需要把握好培養的時(shí)間。

我的經(jīng)驗是：在培養2h后，取出孔板，每孔抽取90微升加入至新孔板，進(jìn)行第一次檢測，看看顯色的深淺程度（仍然需要注意氣泡，若有氣泡需要待氣泡消除后再進(jìn)行檢測）

若顯色較淺，則可除去舊培養基，加入新培養基，再培養1-4小時(shí)，重新加CCK-8步驟，然后將其放入培養箱培養4小時(shí)，再進(jìn)行檢測（其最佳反應時(shí)間為0.5、1、2小時(shí)）

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