分子克隆實(shí)驗的流程及注意事項--四、定點(diǎn)突變

四、定點(diǎn)突變

定點(diǎn)突變引物設計與PCR擴 增
1. 引物設計要求：5’- 15-21bp 反向互補區域 + 至少 15bp 非互補區域 -3’，反向互補區域 GC含量 40%-60%，待突變位點(diǎn)至引物 3 ’ 端 Tm 值 >60°C。根據實(shí)驗需求選擇對應模塊進(jìn)行引物設計；
2. 建議使用試劑盒搭配的擴增模塊進(jìn)行 PCR 擴增，并摸索退火溫度，優(yōu)化反應體系和程序；
3. PCR 擴增體系的模板質(zhì)粒投入量推薦 50 μl 體系投入 1 ng，擴增循環(huán)數應當≤ 35 個(gè)。

擴增產(chǎn)物DpnI消化和純化回收

1.取 5μl 擴增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，判斷是否存在目的大小的條帶后，剩余產(chǎn)物使用 DpnI 消化（45μl 擴增產(chǎn)物加入 1 μl DpnI，輕輕吸打混勻后，在 PCR 儀中 37°C反應 1-2 h消化質(zhì)粒模板，再 70°C反應 15 min 使 DpnI 失活）；
2. 推薦使用切膠回收的方式純化（切膠時(shí)間最好控制在 3 min 內，避免紫外照射對 DNA 的損傷），回收濃度使用 NanoDrop/OneDrop 等儀器檢測，濃度應≥ 20ng/μl，并跑膠鑒定回收產(chǎn)物是否為單一目的條帶；

3. 回收濃度低時(shí)，可通過(guò)增加反應體系，采取多管反應單管回收的方式，提高回收產(chǎn)物的濃度。

重組反應

1.連接反應體系按照說(shuō)明書(shū)要求計算投入量，體系中各組分投入體積≥ 1μl，若濃度過(guò)高可稀釋后使用；
2.連接反應程序按照說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行，建議在 PCR 儀中反應。

感受態(tài)轉化

1. 連接產(chǎn)物轉化的感受態(tài)細胞選擇使用 DH5α、Fast-T1 等克隆用化學(xué)感受態(tài)細胞；
2. 感受態(tài)細胞不可反復凍融使用，-80°C取出后建議一次用完；
3. 重組產(chǎn)物體積與感受態(tài)細胞體積的比例為 1:10，推薦 10μl 重組產(chǎn)物加入至 100μl 感受態(tài)細胞或 5μl 重組產(chǎn)物加入至 50μl 感受態(tài)細胞；
4. 熱激時(shí)間：按照感受態(tài)細胞說(shuō)明書(shū)操作進(jìn)行；
5. 平板抗生素抗性：平板使用抗性與轉化的載體抗性需保持一致；
6. 菌液涂板體積：將菌液離心（2500×g，3min），移液槍吸取丟棄多余 LB 培養基，保留100μl 重懸后全部涂板；或吸取合適體積涂板。

常見(jiàn)問(wèn)題分析：

質(zhì)粒模板無(wú)法正常擴增
1. 引物設計錯誤：反向互補區域長(cháng)度應為 15-21bp 之間，過(guò)長(cháng)過(guò)短均影響重組效率；GC 含量以 40-60% 之間最適，超出范圍影響重組效率。建議使用 CE Design 在線(xiàn)設計；
2. 質(zhì)粒模板質(zhì)量差：凝膠電泳檢測質(zhì)粒模板，若出現開(kāi)環(huán)、線(xiàn)性條帶、拖尾等條帶，說(shuō)明模板質(zhì)量差，需重新制備；
3. PCR 反應體系 / 程序設置不當：質(zhì)粒模板投入量過(guò)多會(huì )抑制 PCR 反應，建議 50μl 體系投入 1ng；基于上下游引物 Tm 值，設定適宜范圍進(jìn)行梯度摸索；質(zhì)粒長(cháng)度超過(guò) 8kb 時(shí)，可嘗試變更為雙 / 多點(diǎn)突變策略，分段擴增。

公式計算投入量；濃度過(guò)高時(shí)需稀釋使用，保證體系投入體積不小于 1μl。