小分子蛋白如何跑WB?

在日常實(shí)驗過(guò)程中，小分子蛋白是非常常見(jiàn)的，常見(jiàn)的凋亡蛋白如Bcl2、Caspase-3、Bax，自噬相關(guān)蛋白如LC3B等均為小分子蛋白，接下來(lái)將從以下幾個(gè)方面分享小分子蛋白跑Wb時(shí)的注意事項：

1. 配膠：整體配膠遵循蛋白分子量越小膠濃度越大的原則，對于小分子蛋白來(lái)說(shuō)，分離膠濃度一般為12%-15%，對于小分子蛋白條帶可以分的更加清晰。同時(shí)在倒膠時(shí)濃縮膠的比例可以適當增加到4：6，使其充分濃縮，后續電泳過(guò)程中一定程度上可以減少彌散。

2. 上樣：根據日常上樣經(jīng)驗，建議在跑小分子蛋白時(shí)增加1倍上樣量，防止蛋白彌散過(guò)多。選擇marker時(shí)，選擇適用于小分子蛋白的marker，后續敷抗體時(shí)可以更清楚的進(jìn)行裁膜。電泳開(kāi)始前可用1′loadingbuffer補齊未點(diǎn)樣的膠孔，防止兩邊不齊跑成“八"字。

3. 電泳：濃縮膠部分設置恒壓70V、30min左右，一般即可濃縮到一條線(xiàn)上之后調大電壓至110V，至所需蛋白區域全部分開(kāi)為止。盡量避免長(cháng)時(shí)間低電壓跑膠，易導致蛋白彌散過(guò)多。同時(shí)整個(gè)電泳過(guò)程中注意降溫。

4. 轉膜：由于小分子蛋白分子量小，吸附能力弱，因此轉膜時(shí)選擇0.22μm的PVDF膜，常規0.45μm膜容易穿透，剩余條件同正常蛋白一般可以滿(mǎn)足條件。

5. 封閉：快速封閉液或脫脂牛奶按正常條件封閉即可。裁膜時(shí)根據marker上下留出足夠多的空間。

6. 一抗孵育：在保證上述條件的基礎上，一抗是出好結果的關(guān)鍵一步，若沒(méi)前期實(shí)驗經(jīng)驗，一抗的稀釋比一般按照說(shuō)明書(shū)配置，若有前期實(shí)驗的經(jīng)驗，可適當進(jìn)行比例調整，一抗濃度過(guò)高最后顯影階段易出現雜帶，過(guò)低則可能看不到條帶。使用1′TBST緩沖液稀釋?zhuān)?℃孵育過(guò)夜。

7. 后續二抗比例及孵育時(shí)間、顯影按常規操作即可。需要注意若抗體不好用或者蛋白難出結果，在敷完一二抗時(shí)可適當延長(cháng)洗膜時(shí)間及次數。

注意事項：

1. 轉膜時(shí)，若蛋白分子量過(guò)小，可適當提高甲醇比例（30%左右）改善吸附能力。

2. 跑小分子蛋白時(shí)marker盡量不跑到一張膜上，對于常見(jiàn)內參GAPDH、Actin及Tubulin等來(lái)說(shuō)，分離膠濃度大上述蛋白區域一般分不開(kāi)或分離不完整，易導致內參不齊。

以上就是本期的內容，更多資訊，歡迎關(guān)注安培生物科技有限公司了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴(lài)的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷(xiāo)售體系的生物高科技企業(yè)?？偛吭O在廣東，服務(wù)面向全國。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗室耗材銷(xiāo)售、技術(shù)服務(wù)與合約開(kāi)發(fā)為一體的專(zhuān)業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號傳導和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應線(xiàn)，在各個(gè)領(lǐng)域內向用戶(hù)提供較高的水平和質(zhì)量穩定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機構、高等院校等客戶(hù)提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)?？梢栽诘谝粫r(shí)間為用戶(hù)提供比較先進(jìn)的專(zhuān)業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專(zhuān)業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠為廣大用戶(hù)提供強大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們在全國主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國內從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專(zhuān)業(yè)性的產(chǎn)品供應商，公司出資存備了大量現貨，配合優(yōu)秀的銷(xiāo)售隊伍以及專(zhuān)業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶(hù)提供服務(wù)