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免疫細胞轉染后細胞毒性較高是為何？

發(fā)布時(shí)間： 2023-01-05　　點(diǎn)擊次數： 1313次

　　免疫細胞轉染時(shí)先吸去培養皿中的培養基，用PBS或者無(wú)血清培養基清洗?次。更換無(wú)血清培養基。準備轉染制備液，?滅菌后的EP管制備。以六孔板為例，A液-200μl Opti-MEM稀釋4μg質(zhì)粒;B液-200μl Opti-MEM稀釋10μl lipo2000，分別將A液、B液輕輕混勻，靜置5min，吸取B液加至A液中，輕輕混勻，室溫靜置20min。
　　加?轉染試劑到每個(gè)孔的培養基中，6h后，更換成全培養基，繼續培養到24-48小時(shí)。
　　免疫細胞轉染在轉染24h后需要觀(guān)察轉染過(guò)程對細胞毒性情況，如果毒性較高，可能是以下原因造成的：
　　1.初期細胞接種濃度太低。
　　2.轉染復合物加入量過(guò)高，因為不同細胞對轉染的敏感度不同。
　　3.轉染后6小時(shí)需更換培養基，一是lipo2000具有一定毒性，二是培養基需要更換成有血清培養基。其次，轉染后需要對轉染效率進(jìn)行檢測，比如觀(guān)察轉染后細胞熒光情況、qPCR驗證或WB檢測敲減或者過(guò)表達蛋白。
　　4.對于β-gal表達載體：可用β-gal染色試劑盒進(jìn)行細胞染色并觀(guān)察細胞。轉染效率高的細胞在染色孵育后3-4h即可觀(guān)察到，轉染效率低的細胞則需要更長(cháng)的孵育時(shí)間。
　　5.對于GFP表達載體：熒光顯微鏡下觀(guān)察細胞。如果細胞能在顯微鏡下被觀(guān)察到，至少需要有104-105拷貝的GFP蛋白表達，表達太弱的細胞無(wú)法鏡檢。GFP表達情況也能使用流式細胞儀進(jìn)行檢測，同時(shí)可加入PI進(jìn)行染色以監測死細胞情況。
　　若是轉染后發(fā)現轉染效率不高，可通過(guò)以下兩種方法增強轉染效率：
　　1.復轉染，即轉染后12-24小時(shí)再次進(jìn)行轉染，前提是該細胞對脂質(zhì)體的耐受性較好，轉染后細胞死亡數較少；
　　2.通過(guò)藥篩來(lái)殺死未轉入成功的細胞。前提是該質(zhì)粒帶有抗生素抗性的基因。

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