背根神經(jīng)節細胞的原代培養實(shí)驗步驟

獲得消毒動(dòng)物后詳細的步驟如下：

1．無(wú)菌條件下仰臥放置胚胎或仔鼠于冰D-PBS液中，斷頭后打開(kāi)胸腹腔，除去內臟器官。從頸部椎管開(kāi)口插入顯微剪，沿脊柱背側中線(xiàn)兩側剪開(kāi)椎管，去除暴露脊髓后，即在椎間孔旁可見(jiàn)到沿脊柱兩側排列的背根節，用精細顯微攝小心提取，并剝除其被膜。

2.若施行組織塊培養，可用精細顯微剪將每個(gè)背根節剖為2-3個(gè)植塊，直接接種于涂有鼠尾膠的基質(zhì)上，加少量含10%胎牛血清的DMEM培養液培養。

3.如若需要背根神經(jīng)節分散細胞培養，則可將分離好的DRG組織塊收集入0.25%胰蛋白酶液中37℃消化30min。加人10滴胎牛血清終止消化后，900r/min離心5min,去除上清。而后依照總論的方法在含10%胎牛血清的DMEM培養液中制成單細胞懸液，調整細胞濃度為(0.5-1)X105/ml接種細胞于多聚賴(lài)氨酸包被的介質(zhì)上，37℃,5%CO2的孵育箱內培養。

4.以上兩種培養方法24h后均傾去培養皿內種植培養液，改用無(wú)血清培養液(Neurobasal+827+谷氨酰胺+20ng/ml NGF)培養。接種第3天，加入細胞分裂抑制劑ARA-C以抑制非神經(jīng)細胞的增殖，作用48h后半量更換新鮮培養液，以后每周1/2量換液2次。

5.純化培養的DRGs可以存活2個(gè)月之久，純度可達96%以上。分散培養的DRG神經(jīng)元48h可見(jiàn)胞體有光暈感，圓形或橢圓形，大小不一，有多極、雙極和假單極神經(jīng)元。2d后給予抑制劑處理后，DRG突起生長(cháng)迅速，形成稀疏網(wǎng)絡(luò )狀結構。隨著(zhù)培養時(shí)間的延長(cháng)，神經(jīng)元突起的主干和分枝明顯延長(cháng)并增粗，神經(jīng)突起網(wǎng)絡(luò )變得更加致密，雜質(zhì)細胞已經(jīng)脫壁漂浮，培養物背景變得干凈清晰很多，免疫細胞化學(xué)進(jìn)一步鑒定培養細胞為神經(jīng)絲(NF)陽(yáng)性（圖1-3)。