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結腸直腸腫瘤細胞的培養

發(fā)布時(shí)間： 2022-12-07　　點(diǎn)擊次數： 808次

原理
通常用酶消化腺瘤，用手術(shù)刀片將癌組織切碎。如果分化良好的結腸直腸癌標本切開(kāi)后仍不易分離細胞，可用酶消化方法分離。
材料與儀器
用于傳代培養的Dispase
生長(cháng)培養液洗液消化液
培養瓶
步驟
一、酶消化

1. 用洗液（洗液：添加 5% FBS、200 U/ml 青霉素、200 ug/ml 鏈霉素和 50 ug/ml 慶大霉素。在原代培養時(shí)，慶大霉素的作用至少維持一周，然后除去。）清洗腫瘤標本 4 次。

2. 將組織塊放入小量洗液中，洗液恰好浸沒(méi)組織塊（避免組織干）。用交叉的手術(shù)刀片或鋒利手術(shù)剪將組織塊剖成約 1 mm3 小塊。

3. 通過(guò)用臺式離心機離心（300 g，3 min），將組織塊清洗 4 次。清洗次數以經(jīng)驗而定，并根據細胞污染情況。

4. 將組織塊放入消化液（消化液：DMEM，添加的抗菌素同洗液，并添加 1.5 mg/ml 膠原蛋白酶（ IV型，Worthington）、0.25 mg/ml 透明質(zhì)酸酶（ I 型，Sigma）和 2.5%~5% FBS。盡管常用 Worthington 公司生產(chǎn)的膠原蛋白酶，也可試用 Sigma 公司生產(chǎn)的培養級別的膠原蛋白酶。），在 37℃ 條件下?lián)u晃，通常過(guò)夜（約 12~16 h )。由于消化是一個(gè)緩慢過(guò)程，組織塊在消化液中的時(shí)間多少并不要緊，重要的是在此過(guò)程中不讓消化液變?yōu)樗嵝?。?pH 說(shuō)明組織塊在消化液中的時(shí)間過(guò)長(cháng)或放入消化液中的組織塊過(guò)多。將約 1 cm3 腫瘤組織放入 20~40 ml 消化液。

二、非酶消化

腺瘤總是需要用酶消化。然而，常發(fā)現在用手術(shù)刀片將癌組織切成 1 mm3 、時(shí)小的細胞簇從腫瘤組織脫落入洗液中。在這種情況，可按下列步驟操作。

1. 收集含有脫落細胞簇的洗液。

2. 將離心管放置幾分鐘，通過(guò)重力使細胞簇沉降，將組織塊與小的細胞簇分開(kāi)。

3. 吸出上清液。

4. 直接培養剩下組織塊，或者將組織塊放入洗液內，輕輕搖晃 30~60 min，以便使更多的小細胞簇脫落下來(lái)，然后收集細胞簇，種植于培養皿內，與剩余的組織塊分開(kāi)培養。

5. 在種植于培養皿內之前，將所有標本洗 3 次。

三、原代培養的標準條件

1. 在預涂膠原蛋白和種植飼養細胞的 25 cm2 培養瓶，用 4 ml 培養液培養從腫瘤組織分離的上皮性小管和細胞簇。

2. 在含有 5% CO2 和 37 ℃ 的培養箱內培養。

3 . 每周換培養液兩次。

小管和細胞在 1~2 d 內開(kāi)始附著(zhù)底物，上皮細胞遷移出來(lái)。大多數小管和小的上皮塊在 7 d 內貼壁，但大的類(lèi)器官物需要 6 周才能貼壁，盡管貼壁時(shí)間有所變化。

如果將細胞接種于預涂膠原蛋白的培養瓶（Biocoat，B-D Biosciences），在原代培養過(guò)程中上皮容易貼壁。與無(wú) 3T3 詞養層相比，將細胞接種于 3T3 飼養層上時(shí)細胞生長(cháng)非常好。當上皮細胞克隆擴增至每個(gè)克隆有幾百個(gè)細胞時(shí)，它們變得不依賴(lài)于 3T3 飼養層，故不必再加入詞養層細胞。

四、繼代培養和擴增

不能用常規的胰蛋白酶和 EDTA 混合液處理方法對大多數結腸直腸腺瘤的原代細胞和腺瘤細胞系進(jìn)行傳代 [ Paraskeva et al.， 1984，1985 ]。由于用 0.1 % 胰蛋白酶（用 0.25 mmol/L EDTA 配制）將腺瘤細胞分散為單細胞導致細胞生長(cháng)很差，故換用 Dispase。

1. 將 Dispase 液注于細胞單層上，恰好浸沒(méi)細胞（每個(gè) 25 cm2 培養瓶約 2.5 ml）。對原代細胞處理 40~60 min，而對細胞系處理 20~40 min。

2. 一旦上皮細胞層開(kāi)始去附著(zhù)（去附著(zhù)的是細胞片，而不是單細胞），用吸管吹打，以促進(jìn)去附著(zhù)，使細胞片分散成細胞簇。

3. 在標準的培養條件下清洗和種植細胞。幾天后細胞簇去附著(zhù)，故應輕輕換液。

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