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昆蟲(chóng)細胞的擴增

發(fā)布時(shí)間： 2022-12-07　　點(diǎn)擊次數： 724次

原理
用機械法從細胞單層分離細胞，在 27°C 條件下和懸浮狀態(tài)下進(jìn)行擴增培養。
材料與儀器
Sf9細胞二甲基亞砜 Pluronic F68
生長(cháng)培養液
培養瓶旋轉培養瓶和磁力攪拌器 27°C培養箱
步驟
常規維持培養

1. 通過(guò)刮取法或用培養液沖洗細胞（( ATCC # CRL-1711 ) 或從甘藍環(huán) Trichoplusia ni 獲得的細胞系（Tn 368 或 BTI-TN-5B1-4，也稱(chēng) “High Five "，可從 Invitrogen 購買(mǎi)））法使細胞從培養瓶中脫落，或者利用在旋轉瓶中懸浮生長(cháng)的細胞。

2. 用血細胞計數板計數細胞，通過(guò)用臺盼藍或萘黑染色檢査細胞的活力。

3. 以 0.5~1×106 個(gè)/ml 活細胞密度將細胞種植于旋轉培養瓶?jì)?，?500 ml 旋轉瓶?jì)茸⑷?20~100 ml 細胞懸液。

4. 在 20~28°C 條件下培養細胞，以 37°C 為佳。

5. 每 48~72 h 或當細胞密度為 4~5×106 個(gè)/ml 時(shí)，將細胞稀釋至 0.5~1×106 個(gè)/ml。

6. 每 3~4 周將細胞移入潔凈的培養瓶。

7. 如果細胞群聚集，稍微加快攪拌速度，并加入表面活性劑 Pluronic F-68 [ 0.5%~1.0% (v / v ) ]，以降低剪切力。

凍存細胞

1. 計數細胞，離心（1000 rpm ，約 200 g，5 min )。

2. 用 10% DMSO ( 用 FBS 配制）混懸細胞，密度為 1×107 個(gè)/ml。

3. 將細胞分裝入凍存管，然后將凍存管放在冰上 1 h。

4. 將凍存管裝入苯乙烯泡沫容器。

5. 在 -70°C 條件下將凍存管緩慢冷凍過(guò)夜（約 1°C /min )。

6. 將凍存管移入液氮凍存器中。

7. 使凍存的細胞復蘇時(shí)，將凍存管在 37°C 迅速融化。如果細胞以液相儲存，在融化加蓋容器中的細胞時(shí)應注意避免因凍存管破裂而導致受傷的危險。

8. 將細胞移入含 5 ml 培養液的 25 cm2 培養瓶。輕拍培養瓶，以便均勻地分散細胞。

9. 2~3 h 后吸去培養液。當大多數細胞貼壁時(shí)，加入 5 ml 新鮮培養液。

10. 在分離前將細胞培養 2~3 天，使細胞恢復。然后按前述方法，將細胞移入攪拌培養瓶或更大的塑料瓶。

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