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冷胰蛋白酶解離組織

發(fā)布時(shí)間： 2022-12-09　　點(diǎn)擊次數： 1089次

原理
剪碎的組織放在胰蛋白酶中于4°C 放置16~18h ，去除胰蛋白酶后溫育并于溫培養基中分散細胞。
材料與儀器
組織 DBSS 粗制胰蛋白酶
生長(cháng)培養基皮氏平皿
培養瓶鑷子移液管錐形瓶剪刀冰浴
步驟
1. 將組織（1~5 g，預先稱(chēng)重）移入加有新配制的無(wú)菌 DBSS 的皮氏培養皿中，清洗。

2. 轉入另一培養皿中，切除多余組織如脂肪和壞死組織。

3. 轉入第三個(gè)培養皿中，用交叉的手術(shù)刀細切成大約 3 mm3 的小塊。胚胎的器官若小于 3 mm3 ，可全部保留。

4. 用彎鑷子將組織塊移入一個(gè)預稱(chēng)重的 15 ml 或 50 ml 無(wú)菌離心管內。

5. 讓組織塊沉降。

6. 用 DBSS 重懸清洗組織塊，沉降后去除上清，重復此步驟兩次以上。

7. 小心去除剩余液體，預先稱(chēng)重。

8. 每克組織加入 10 ml 溶于 RPMI1640 或 S-MEM 的 0.25 % 胰蛋白酶（0.25 粗制胰蛋白酶溶于無(wú)血清的 RPMI1640或 MEM/Stirrer salt (S~MEM ) 中），置于 4°C 。

9. 4°C 放置 6~18 h 。

10. 小心吸去胰蛋白酶，余下組織及殘余胰蛋白酶（若需要，此時(shí)可加人 1~2 ml 其他酶，如膠原酶、透明質(zhì)酸酶、脫氧核糖核酸酶等）。

11. 37°C 放置 20~30 min 。

12. 加入溫培養基，大約每 100 mg 初始的組織加 1 ml，輕輕上下吸打混合物至組織完-全分散開(kāi)。

13. 若部分組織未分散，細胞懸液可用無(wú)菌的平紋紗布或不銹鋼篩（100~200 μm )，或一次性使用的塑料篩濾網(wǎng)過(guò)濾細胞，或者讓大的組織塊沉降。當有較多組織時(shí)，可于每克組織中多加入 20 ml 培養基促進(jìn)沉淀和隨后的懸液收集，通常 2~3 min 就足以去除大多數的大塊組織。

14. 用血球計數板或電子計數儀測定懸液的細胞密度，檢査活細胞比率。

15. 細胞群體為異源性，由于校準口徑較困難，因而初次使用電子計數儀時(shí)，需要用血球計數板來(lái)確認。

16. 將細胞懸液生長(cháng)培養基（生長(cháng)培養基（如DMEM/F12，含10% 胎牛血清））稀釋?zhuān)姑亢辽囵B基含有 1×106 個(gè)細胞。按照需求接種于多個(gè)培養瓶（25 cm2、75cm2 培養瓶）中，大約每平方厘米為 2×105 個(gè)細胞。當存活率不明確或難以預知時(shí)，細胞計數便無(wú)價(jià)值（如腫瘤活檢時(shí)，死亡細胞的比例很高）。在這種情況下，建議按每毫升 5~25 mg 組織的濃度接種。

17. 間隔一定時(shí)間更換一次培養基（2~4 天，以 pH 下降為標準）。由于部分細胞黏附較慢甚至易于懸浮生長(cháng)，所以丟棄上清前要先檢査上清液中是否有存活的細胞。

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