miRNA實(shí)驗解決方案（操作手冊）---第二章：miRNA提取

一、miRNA提取的方法

miRNA提取的難點(diǎn)在于其分子太小，不易被醇類(lèi)沉淀，也不易被常規的硅膠吸附膜吸附。miRNA的提取方法主要有兩種形式，一種是提取樣品中的總RNA后，通過(guò)PAGE電泳或PEG，將總RNA中的小片段RNA分離出來(lái)，最后對小片段的RNA進(jìn)行沉淀回收，從而獲得miRNA。另一種是硅膠柱吸附法，采用特殊硅基質(zhì)吸附材料在添加適量乙醇的條件下，可特異吸附小片段RNA（小于200nt），最終得到miRNA。傳統方法提取miRNA通常采用第一種，而miRNA提取試劑盒一般采用硅膠柱吸附法。前者的主要缺點(diǎn)在于實(shí)驗步驟較為繁瑣，影響因素較多，最終獲得的miRNA純度較差，不利于后續實(shí)驗；而后者操作簡(jiǎn)便，獲得的miRNA純度良好。

二、miRNA提取的操作流程

miRNA提取
Vazyme動(dòng)物細胞和組織miRNA柱式提取試劑盒-MiPure Cell／Tissue miRNA Kit（ Vazyme #RC201)。

·Vazyme ＃RC201產(chǎn)品優(yōu)勢

1．高效的提取效率：有效分離長(cháng)度20～200nt的小片段RNA。

2．簡(jiǎn)便的操作流程：結合高效的RNA Isolater抽提試劑和硅膠柱純化技術(shù)，1h內完成miRNA提取。

3．廣泛的適用性：提取的miRNA純度高，兼容常規qPCR、Northern雜交、芯片分析及miRNA文庫構建。

Vazyme ＃RC201實(shí)驗案例-一非常高的提取效率

使用 MiPure Cell ／Tissue miRNA Kit （Vazyme ＃RC201）與total RNA提取試劑（Trizol）分別從等量樣本（細胞或小鼠肝臟組織）中提取miRNA、total RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測等量產(chǎn)物，結果如下圖所示：對于細胞或小鼠組織，Vazyme ＃RC201提取得到的產(chǎn)物中不含有大分子RNA，如18S、28S rRNA。通過(guò)qPCR實(shí)驗檢測等量產(chǎn)物中miR-16基因，結果顯示，Vazyme ＃RC201 對于miRNA的提取產(chǎn)量?jì)?yōu)于Trizol法。

注意事項

1．本制品的裂解液RNA Isolater中含有C6H6O，具有毒性和腐蝕性。如果吸入體內、接觸皮膚、吞食等會(huì )導致中毒、灼傷以及其他身體傷害。使用本制品時(shí)應穿戴防護物品，如防護服裝、手套、面罩等。

2．所有操作步驟，如果沒(méi)有特別指出，均在常溫條件下（15～25℃）進(jìn)行。

3．RNA得率和質(zhì)量與組織樣本用量和洗脫體積有關(guān)，建議每1ml RNA Isolater 裂解 10～100mg組織，或不多于5x106個(gè)細胞。洗脫體積應不少于30μl，否則會(huì )影響RNA的得率。

4．使用本試劑盒時(shí)，請穿戴實(shí)驗服、一次性乳膠手套、一次性口罩等，最大限度的避免RNase 污染。

5．樣本的選擇及保存會(huì )很大程度上影響RNA的產(chǎn)量以及質(zhì)量。應盡可能的采用新鮮的動(dòng)物組織或細胞進(jìn)行RNA提取。如果采集的樣本暫不提取RNA，可以將新采集的樣本立即置于液氮中速凍后于-70℃保存，并且避免反復凍融，或者將樣本立即置于RNA Isolater裂解液中勻漿后，置于-70℃保存。為了避免RNA的降解，樣本的采集與保存應盡可能迅速地進(jìn)行。

6．樣本破碎需全部破壞細胞膜及細胞器以釋放RNA，破碎不充分將影響RNA的產(chǎn)量，勻漿時(shí)盡量低溫，防止因勻漿過(guò)程中產(chǎn)生的熱量導致RNA降解。

7．RNA在RNA Isolater中不會(huì )被 RNase 污染，但裂解后處理過(guò)程應保證RNase-free環(huán)境。

8．本試劑盒可去除體系中基因組DNA，純化獲得的RNA通常無(wú)需使用DNase處理即可用于下游實(shí)驗操作。如果下游實(shí)驗對痕量的DNA十分敏感，可以選用商業(yè)化RNase-freeDNase 全部清除。

實(shí)驗流程

1．樣品的處理

樣品的均質(zhì)化處理是所有RNA提取所必需的步驟。通過(guò)吹打或勻漿讓細胞或組織塊快速分散、細胞壁和細胞質(zhì)膜破裂，從而使核酸釋放到裂解液中。均質(zhì)化不充分可能會(huì )導致RNA產(chǎn)量和純度下降。下面列舉了幾種常見(jiàn)的樣品均質(zhì)化處理方法：

1.1 液氮處理

切取適量組織稱(chēng)重，置于預冷的研缽中，迅速加入液氮，將組織研磨成粉末，然后將粉末倒入預冷的離心管中（注意：預先冷卻離心管，否則樣品倒入時(shí)，液氮沸騰會(huì )造成樣品損失）。待液氮全部揮發(fā)后，加入適量的RNA Isolater渦旋混勻。由于液氮研磨只能起到打散樣品的作用，所以最好再用注射器吹打或機械勻漿器勻漿，以降低裂解液的粘稠度。

1.2機械勻漿器勻漿

機械勻漿器能高效勻漿大部分組織和細胞，并同時(shí)起到打散和勻漿的作用。把樣品置于合適的1～5ml玻璃管或離心管中，加入RNA Isolater，把轉子插入RNA Isolater中，低溫高速間斷勻漿，每次為10～30sec，間隔相同時(shí)間直至樣品全部勻漿。使用機械勻漿器時(shí)，一般組織都可以在一分鐘內達到理想的勻漿效果。大部分的機械勻漿器都帶有不同大小的轉子，小體積的裂解液適合使用較小的轉子。

1.3 玻璃勻漿器

把樣品和適量的裂解液轉移至玻璃勻漿器中，上下推磨直至組織塊被充分打散。

2．RNA的提取

小分子RNA的提取可分為細胞小分子RNA和動(dòng)物組織小分子RNA，不同小分子RNA的提取均可使用Vazyme ＃RC201，提取原理及流程概要如下：

2.1 細胞小分子的RNA的提取

該方案適合于從少于5x106個(gè)培養細胞樣品中富集小分子RNA（＜200nt）。

（1）收集細胞。

a．懸浮培養細胞：計算細胞數量，300g離心5min收集細胞，小心棄除培養液，按2.1中的第2步進(jìn)行操作。

b.貼壁細胞：貼壁細胞可在培養瓶／皿中直接裂解，也可經(jīng)胰酶消化后離心收集。

直接裂解：計算細胞數量，全部棄除培養液，按2.1中的第2步進(jìn)行操作。

胰酶消化處理：計算細胞數量，棄除培養液，加入適量PBS清洗細胞，棄除PBS，再加入含0.1～0.25％胰酶（Trypsin）的PBS消化細胞。當細胞從壁上脫落后，加入含血清的培養液，并轉移至離心管，300g離心5min。收集細胞，按2.1中的第2步進(jìn)行操作。

（2）加入1ml RNA Isolater至細胞樣品中，渦旋或吸打處理細胞沉淀團。

離心收集的細胞：先彈打使細胞松散，再加入1ml RNA Isolater，用移液槍吸打10～15次全部打散細胞。貼壁細胞直接裂解：全部棄除培養液后，向培養瓶或培養皿中加入1 ml RNAIsolater。用槍吹打使細胞從壁上全部脫落，收集裂解液，并轉移至離心管中。

（3）室溫放置2～3min 讓細胞充分裂解。

此時(shí)樣品可在2～8℃保存一周，-20℃至-70℃保存六個(gè)月以上。

（4）加入200μlCHCL3至裂解液中，用手劇烈振蕩15sec，室溫靜置3min。

用渦旋取代振蕩可能會(huì )帶入基因組DNA污染。

（5）4℃，12,000 rpm（13,400xg）離心15 min。吸取500μl的上清液至新的1.5ml離心管中。

請小心吸取上清水相，避免吸到中間層和下層有機相而影響后續提取結果。

（6）加入160μl的無(wú)水乙醇至上清液中，渦旋混勻10sec。（以下離心均在室溫下進(jìn)行）

（7）把RNA柱（MiPure RNAspin Column）置入2ml收集管（Collection Tube）。將上述混合液轉移至RNA柱中12,000rpm（13,400xg）離心30 sec。

（8）加入0.9倍體積的無(wú)水乙醇至濾液中，用移液槍吸打混勻3～5次。

舉例：若濾液體積為640μl，則需加入576μl無(wú)水乙醇。

（9）把miRNA柱（MiPure miRNA Column）置入2ml收集管中。轉移一半體積的混合液至miRNA柱中12,000rpm（13,400xg）離心30 sec。

（10）棄濾液，把miRNA柱置回收集管中。轉移剩余混合液至miRNA柱中，12,000 rpm（13,400xg）離心30sec。

（11）棄濾液，把miRNA柱置回收集管中。加入500 μl Buffer miRW1（已加乙醇）至miRNA柱中，室溫放置1min，12,000 rpm（13,400xg）離心30sec。

（12）棄濾液，把miRNA柱置回收集管中。加入500 μl Buffer miRW2（已加乙醇）至miRNA柱中，室溫放置1min，12,000 rpm（13,400xg）離心30sec。

（13）棄濾液，把miRNA柱置回收集管中。加入500μl80％乙醇（需用RNase-freeddH2O新鮮配制）至miRNA柱中，室溫放置1 min，12,000 rpm（13,400xg）離心30 sec。

（14）棄濾液，把miRNA柱置回收集管中。12,000rpm（13,400xg）離心空柱2min，甩干miRNA柱的基質(zhì)。這一步可全部去除miRNA柱中殘留的乙醇。

（15）將miRNA柱轉移至新的1.5ml離心管，室溫晾干2~5min,加入MiPure miRNA Column 最小的洗脫體積是30μl，小于30μl會(huì )致RNA的洗脫效率下降。

（16）丟棄miRNA柱，收集的miRNA樣品于-70℃保存。

2.2 動(dòng)物組織小分子RNA的提取

該方案適合于從少于100mg動(dòng)物組織中富集小分子RNA（＜200nt）。

（1）組織用量：組織用量是RNA產(chǎn)量和純度的關(guān)鍵因素。試劑盒的組織用量可低至0.01mg，但最大的組織用量取決于樣品中RNA、蛋白質(zhì)和雜質(zhì)的含量。

動(dòng)物腦組織、脂肪組織，RNA含量較低，組織最大用量可至100mg。

動(dòng)物肝臟、脾臟、腎臟、胸腺等，含有豐富的RNA，組織用量不要超過(guò)20mg。

心臟、肌肉、皮膚含有中豐度的RNA，組織用量不要超過(guò)50mg。

＊MiPure miRNA Column結合能力為200μg。過(guò)多的組織用量會(huì )造成RNA降解及大分子RNA的污染。如果處理的組織沒(méi)有相關(guān)的信息，推薦第一次起始用量為30mg，根據獲得的結果來(lái)提高或降低組織的用量。

（2）組織的裂解和勻漿：按10～100mg的組織量，加入1ml RNA Isolater。

（3）室溫放置2～3min讓組織充分裂解。

（4）（可選）4℃，12,000rpm（13,400xg）離心10min。小心吸取上清液至新的離心管中。

處理脂肪樣品時(shí)，離心后溶液表面會(huì )飄浮一層油脂類(lèi)，小心轉移下層清液至新管。

（5）加入200μlCHCL3至裂解液或上清液中。用手劇烈振蕩15 sec，室溫靜置3min。

用渦旋取代振蕩可能會(huì )帶入基因組DNA污染。

（6）4℃，12,000 rpm（13,400xg）離心15min。吸取500μl上清液至新的1.5ml離心管中。

請小心吸取上清水相，避免吸到中間層和下層有機相而影響后續提取結果。

按2.1的第6～16步進(jìn)行操作富集小分子RNA。

三、miRNA提取的常見(jiàn)FAQ

離心后分層不明顯？

1．沒(méi)有加CHCL3或CHCL3不純：確保加入CHCL3，且不含有3-甲基丁醇或其它添加成分。

2．加入CHCL3后混勻效果不好：加入CHCL3后，一定要劇烈振蕩混勻15sec。顛倒或渦旋會(huì )導致分離不明顯或引入DNA污染。如果離心后分離不明顯，重復振蕩和靜置，然后再離心。

3．樣品中含有機溶劑：若樣品含有有機溶劑如DMSO、乙醇、強堿試劑會(huì )影響分層。

RNA產(chǎn)量低？

1．樣品勻漿不充分：處理培養細胞時(shí)，反復吹打裂解液進(jìn)行裂解；處理動(dòng)物組織時(shí)，推薦使用機械勻漿器勻漿。

2．樣品起始用量太多：根據說(shuō)明書(shū)給出的參考用量及實(shí)際情況來(lái)決定樣品用量。

3．RNA的洗脫效率低：RNase-free ddH2O沒(méi)有加到膜上，或洗脫體積不夠?？杉尤腩A熱的30～50 μl RNase-free ddH2O到膜上，室溫靜置2min，然后離心洗脫RNA。

RNA降解？

1．組織／細胞用量太多：減少樣品用量，正確的樣品用量是獲得理想結果的必要條件。

2．RNase 污染：操作過(guò)程避免RNase的污染。戴一次性干凈手套；在單獨潔凈的區域操作；戴口罩并在操作過(guò)程中避免講話(huà)；使用RNase-free的實(shí)驗器具，包括槍頭和離心管；RNA實(shí)驗所用器具與試劑都應專(zhuān)用，避免混用后造成交叉污染；RNase-free ddH2O建議分裝后保存。

下游實(shí)驗結果不理想？

1．鹽分污染：加入Buffer miRW2或80％乙醇后，靜置2min后再離心。

2．乙醇污染：空柱離心轉速高于或等于12,000rpm（13,400xg），離心時(shí)間為2min。

3．膜材料脫落：脫落到產(chǎn)物中的硅膠膜是不溶解的，可通過(guò)12,000rpm（13,400xg）離心2min，僅分離含有小RNA的液體成分保存。

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