miRNA實(shí)驗解決方案（操作手冊）---第四章：Small RNA 建庫

一、Small RNA 的概念

Small RNA是長(cháng)度小于200nt的一類(lèi)非編碼RNA，承擔著(zhù)關(guān)鍵性的調控功能，主要包括三類(lèi)，分別是miRNA、piRNA以及 siRNA，其中以miRNA研究最為廣泛。Small RNA的5'和3'末端分別有自由的磷酸基和羥基，正是基于這一結構特點(diǎn)，Small RNA測序采用5'、3'兩端連接接頭法進(jìn)行Small RNA文庫構建。

二、Small RNA建庫的原理

1.3'接頭連接

將RNA和3'接頭置于70℃條件下進(jìn)行變性，打開(kāi)RNA及3'接頭可能存在的二級結構。利用酶將 Small RNA的3'羥基和3'通用接頭進(jìn)行連接。

2．多余3'接頭封閉

為了防止多余的3'接頭與5'接頭連接產(chǎn)生接頭二聚體，在5'接頭連接之前，需要將多余的3'接頭進(jìn)行封閉。封閉是通過(guò)加入RT Primer與多余的3'接頭反向互補形成雙鏈結構，從而有效阻止其與5'接頭連接，達到減少接頭二聚體的目的。

3.5'接頭連接

5'接頭連接是基于Small RNA的5'端含有磷酸基團，利用酶將5'接頭與Small RNA進(jìn)行連接。如需要測試的Small RNA 5'端不含磷酸基團，則連接不上5'接頭。5'接頭為RNA接頭，自身可能形成二級結構，使用前需要將5'接頭的二級結構打開(kāi)。

4．cDNA合成

利用3'接頭封閉時(shí)加入的RT Primer作為引物進(jìn)行逆轉錄合成cDNA。

5．PCR富集

使用帶有P5、P7的引物進(jìn)行文庫富集。

6．文庫分選

擴增后的文庫會(huì )有擴增引物殘留及rRNA污染。純化后的文庫推薦使用PAGE膠進(jìn)行分選，可直觀(guān)獲得目的條帶。也可以使用雙輪磁珠分選，但分選范圍較廣，得到的Small RNA文庫純度較低。分選后的文庫miRNA在147bp處左右。

三、Small RNA建庫的操作流程

·Small RNA 建庫

Vazyme 針對 lllumina 高通量測序平臺定向開(kāi)發(fā)的Small RNA文庫構建專(zhuān)用試劑盒-VAHTS Small RNA Library Prep Kit for lllumina V2 (Vazyme #NR811)。

· Vazyme ＃NR811 產(chǎn)品優(yōu)勢

1．文庫豐度高：接頭污染少，有效文庫比例高，miRNA比例高、覆蓋種類(lèi)多，文庫數據質(zhì)量可靠；

2．樣本兼容范圍廣：動(dòng)、植物細胞／組織總RNA，分離純化的Small RNA，以及其他類(lèi)型總RNA（如外泌體總RNA）均可作為起始模板；起始模板投入低至10ng總RNA；

3．多種純化方式可選：NR811中包含文庫構建所需的所有組分，提供磁珠分選和PAGE膠分離兩種文庫純化方式，可根據起始文庫質(zhì)量任意選擇。

自備材料

1.Small RNA Index Primer

VAHTS Small RNA Index Primer Kit for Illumina (Vazyme #N813-816)。

2．RNA質(zhì)控

Agilent RNA 6000 Pico Kit (Agilent #5067-1513)。

3．文庫質(zhì)控

Agilent DNA 1000 kit (Agilent #5067-1504)、Agilent High Sensitive Kit (Agilent #5067-4626)。

4．文庫純化

VAHTS DNA Clean Beads (Vazyme #N411)。

5．文庫分選

5.1PAGE膠分選：

6% Novex TBE PAGE gel 1.0 mM 10-well (Life Technologies #EC6265BOX)、5 x TBE、Ultra GelRed Nucleic Acid Stain （Vazyme ＃GR501）或 SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain（Life Technologies ＃S11494）、3M醋酸鈉（pH 5.2）、無(wú)水乙醇、新鮮配制的80％乙醇。

5.2磁珠分選：

VAHTS DNA Clean Beads（Vazyme ＃N411）、新鮮配制的80％乙醇。

6．其他材料

Nucleas-free ddH2O、RNase-free PCR管、低吸附EP管（Eppendorf＃022431021）； Agilent 2100 Bioanalyzer或其他等效產(chǎn)品、PCR儀、磁力架、-80℃冰箱、水浴鍋、離心機。

·注意事項

1．試劑盒各組分應于標注條件下保存：

1.15'接頭RL5 Adaptor為RNA接頭，請置于-85～-65℃保存。

1.2 試劑盒中的各酶類(lèi)組分，請置于-30～-15℃保存。使用前混勻并進(jìn)行短暫離心，避免粘附于管壁及管蓋，造成損失；使用時(shí)應置于冰上，使用后及時(shí)按條件保存，否則會(huì )導致酶活降低。

1.3 RL3 Buffer V2比較粘稠，解凍混勻后請短暫離心收集至管底，避免液體粘附于管蓋和管壁，導致試劑損失。

2．RNA樣品質(zhì)控：

為保證建庫質(zhì)量，實(shí)驗開(kāi)始前請對RNA樣品進(jìn)行質(zhì)控，RNA樣品總量、純度和完整性應滿(mǎn)足以下條件：

2.1以總RNA為起始模板，請使用沉淀法（如trizol法）或者Small RNA專(zhuān)用提取試劑盒提取RNA樣品，確保所使用的提取方法不會(huì )損失 Small RNA。

2.2總RNA模板的起始投入量應≥10ng，若起始投入量過(guò)低，不能確保文庫構建成功。

2.3 OD260／280比值介于1.8-2.2之間，使用Bioanalyzer進(jìn)行RNA完整性檢測，RIN值27；使用瓊脂糖凝膠電泳檢測，則28S：18S≥1.5，且無(wú)蛋白質(zhì)和基因組污染。

3．操作過(guò)程注意事項：

3.1實(shí)驗過(guò)程中請使用RNase-free的槍頭、EP管、PCR管，吸取不同樣品時(shí)請更換槍頭。

3.2 請佩戴手套、口罩操作，接觸RNase-free空間外設備或其他工作區間后，請更換手套。

3.3 所有的試劑使用后請立即蓋上管蓋，避免污染。

3.4實(shí)驗過(guò)程中如需暫停，請嚴格按照使用方法中注明的可停放點(diǎn)將樣品置于合適的溫度下保存，不正確的停放可能會(huì )降低建庫成功率。

實(shí)驗流程

1.3'接頭連接

將RL3 Adaptor、RL3 Buffer V2、RL3 Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

不同起始量RNA投入，所需接頭量不同，接頭量不足產(chǎn)出不夠，接頭過(guò)量則接頭二聚體殘留較多。推薦按照下表對接頭進(jìn)行稀釋、如血清、血漿、外泌體RNA提取產(chǎn)物低于Qubit測定下限，則按照最大體積6μl投入，推薦按照10ng總RNA接頭稀釋倍數進(jìn)行稀釋。

1.1 模板與接頭變性

將RNA底物自身以及RNA底物之間可能存在的二級結構打開(kāi)。根據模版RNA起始投入量稀釋 RL3 Adaptor，在RNase-free的PCR管中按照下表配制反應體系。

1.2將PCR管置于提前預熱至70℃的PCR儀中反應2min，反應結束后立即取出置于冰上2 min。

1.3向1.2的反應管中依次加入如下組分：

1.4使用移液器吹打10-15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

2．多余3'接頭封閉

將RT Primer取出，解凍并混勻，短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

2.1 根據模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RT Primer，再按照下表配制反應體系。

2.2 使用移液器吹打10～15次混勻，短暫離心收集至管底。置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

3.5'接頭連接

將5'接頭RL5 Adaptor、RL5 Buffer和RL5 Enzyme mix取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用，以下所有步驟均在冰上操作。

3.1 5'接頭變性

RL5 Adaptor 自身可能形成二級結構，使用前需變性打開(kāi)二級結構。根據模版RNA起始投入量，參照表格稀釋RL5 Adaptor，將稀釋好的RL5 Adaptor置于提前預熱至70℃的PCR儀中反應2min，反應結束后立即取出置于冰上。

3.2 按照下表配制5'接頭連接反應體系：

3.3 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

4． cDNA合成

將RT Buffer和 RT Enzyme mix V2取出，解凍并混勻、短暫離心收集至管底，置于冰上備用。

4.1 按照下表配制逆轉錄反應體系：

4.2 使用移液器吹打10～15次充分混勻，短暫離心收集反應液至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下程序：

5．文庫富集

將Universal Primer、Index Primer和 Amplification mix 3取出，解凍混勻后置于冰上備用。5.1 按照下表配制反應體系：

5.2將上述反應液混勻，短暫離心收集至管底。將反應管置于熱蓋的PCR儀中運行如下反應程序：

6．PCR產(chǎn)物純化

6.1 將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其平衡至室溫。

6.2 顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads 充分混勻，吸取180μl（1.8x）加入到PCR產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。

6.3 室溫孵育10min，使DNA結合到磁珠上。

6.4 將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約10min），小心移除上清。

6.5 保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫孵育30 sec，小心移除上清。

6.6 重復6.5一次。

6.7 保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠約5min。

加入80％乙醇時(shí)不要吹散磁珠。

最后移除上清時(shí)需使用10μl移液器將殘留液體吸干凈，避免磁珠過(guò)分干燥（龜裂）而降低回收效率。

6.8 將樣品從磁力架上取出，加入30μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取28μl上清至一個(gè)新的Nuclease-free PCR管中。

洗脫產(chǎn)物可在-30～-15℃暫存一周。

6.9 Agilent 2100 Bioanalyzer 檢測文庫：取1μl純化后的PCR產(chǎn)物用 Agilent DNA 1000 chip分析，由于2100遷移率的影響，最終文庫的主峰分布可能存在約6-8bp偏差，如下圖所示：miRNA文庫的峰在143-147 bp處，piRNA文庫的峰在153-156bp處。

注：A圖和B圖分別為1μg、100ng小鼠肝臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA；C圖為1μg小鼠腎臟總RNA起始的Small RNA文庫，147 bp處的主峰為miRNA，153 bp處的主峰為piRNA。

7.文庫分選

根據6.9步驟中文庫質(zhì)控的結果選擇文庫分選純化方式，如2100圖顯示120 bp處有較多接頭二聚體、70-80 bp處有較多擴增引物殘留以及160bp和190 bp處有明顯的rRNA，則建議選擇PAGE膠分離；如接頭二聚體、擴增引物殘留以及rRNA較少則可以選擇磁珠進(jìn)行文庫分選。為確保最終有效文庫的比例，建議使用PAGE膠進(jìn)行文庫分選。方案A：6％非變性PAGE膠分選文庫

（1）將6％10孔非變性PAGE膠裝置于電泳槽中，向其中加入適量1xTBE電泳緩沖液。

（2）向純化的PCR產(chǎn)物中加入5μl6xLoading Buffer 混勻后離心收集至管底。

（3）取5μl pBR322／Mspl digest DNA Marker緩慢加入PAGE膠樣孔中。

（4）將混有Loading Buffer的PCR產(chǎn)物緩慢加入PAGE膠樣孔中，每個(gè)樣品上兩個(gè)樣孔，每孔15μl。

（5）上樣完成后，120-150V電壓電泳約1h，不同的電泳裝置電泳遷移速率可能不一致，所需電泳時(shí)間有差異，待樣孔中的Loading Buffer藍色指示劑全部跑出膠板后約3-5min方可停止電泳。

（6）將PAGE膠從電泳裝置中取出，將PAGE膠從膠板上剝下。用Gel-red核酸染料染色10 min，在凝膠成像儀中進(jìn)行觀(guān)察，如下圖所示，大約140bp和150 bp處的條帶分別對應于miRNA文庫和piRNA文庫的條帶。

（7）用刀片將對應的條帶割下放于事先準備好的500μl低吸附EP管中（管底已用酒精燈燒過(guò)的1ml注射器針頭戳了數個(gè)小洞），將500 μl EP管套到1.5ml低吸附EP管中，12,000 rpm（13,800xg）離心2min碾碎膠條。膠條的碾碎程度取決于500μl EP管底部小洞的孔徑，所以只需使用注射器針頭戳穿即可。

（8）離心完成后棄掉500μl EP管，向裝有PAGE膠碎片的1.5ml EP管中加入250 μl GEBuffer，于50℃水浴鍋中溫育1-2h。

（9）將步驟8的EP管于離心機中12,000 rpm（13,800xg）離心2min，將蒸發(fā)到管壁的液體收集至管底。

（10）將步驟9的上清轉移至離心過(guò)濾柱 Filtration Column中12,000 rpm（13,800xg）離心2 min 收集液體，棄去離心柱，將液體轉移至新的1.5ml低吸附EP管中。

（11）向步驟10的上清中分別依次加入5μl Co-precipitator，30 μl 3M醋酸鈉（pH 5.2）和1ml無(wú)水乙醇，振蕩混勻后于-80℃沉淀1h。

（12）取出-80℃沉淀產(chǎn)物，于預冷至4℃的冷凍離心機中12,000 rpm（13,800xg），離心30 min。

（13）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。向EP管中加入1ml新鮮配制的80％乙醇，于預冷至4℃的冷凍離心機中，12,000 rpm（13,800xg）離心10min。

（14）小心移除上清，注意切勿吸取到白色沉淀。短暫離心將管壁上殘留的液體收集至管底，小心移除殘留液體，室溫開(kāi)蓋干燥約10min。

（15）待步驟14產(chǎn)物中殘留的酒精全部揮發(fā)，加入15μl Nuclease-free ddH2O溶解沉淀。
（16）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應該如下圖所示，對應的miRNA文庫條帶在147-149bp處。
                 

方案B：雙輪磁珠分選文庫

（1）將VAHTS DNA Clean Beads提前30 min從2～8℃取出，靜置使其溫度平衡至室溫。

（2）顛倒或渦旋振蕩使VAHTS DNA Clean Beads充分混勻，取25μl純化的PCR產(chǎn)物于200 μl PCR管中吸取32.5μl 磁珠（1.3x）加入到PCR產(chǎn)物中，使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。

 ( 3）室溫孵育5min，使DNA結合到磁珠上。

（4）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心移取上清至新的Nuclease-free PCR管中。

（5）向步驟4的產(chǎn)物中加入22.5μl磁珠（0.9x），使用移液器輕輕吹打10次充分混勻。（6）室溫孵育5min，使DNA結合到磁珠上。

（7）將樣品置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心棄去上清。

（8）保持樣品始終處于磁力架上，加入200μl新鮮配制的80％乙醇漂洗磁珠，室溫下孵育30sec，小心移除上清。

（9）重復步驟8一次。

（10）保持樣品始終處于磁力架上，室溫下開(kāi)蓋干燥磁珠約5min。加入80％乙醇時(shí)不要吹散磁珠；最后移除上清時(shí)需要使用10μl移液器將殘留液體吸干凈；應避免磁珠過(guò)分干燥（龜裂）而降低回收效率。

（11）將樣品從磁力架上取出，加入17.5 μl Nuclease-free ddH2O，使用移液器輕輕吹10次打充分混勻，室溫靜置2 min后置于磁力架上，待溶液澄清后（約5min），小心吸取15μl上清至一個(gè)新的Nuclease-free PCR管中。

（12）2100檢測分選純化的文庫：取1μl分選純化的產(chǎn)物用Agilent DNA 1000 chip 或Agilent high sensitive chip分析，良好的文庫應該如圖所示，對應的miRNA文庫條帶在147-149 bp處。

四、Small RNA建庫的常見(jiàn)FAQ

RT primer 能否在cDNA合成步驟添加？

不能。3'接頭連接完成后加入的RT primer與多余3'接頭反向互補形成雙鏈結構，可以有效阻止5'接頭與3'接頭連接，從而減少接頭二聚體的形成；另外，RT primer與已連上3'接頭的RNA底物方向互補可作為逆轉錄步驟的引物，因此RT primer必須在3'接頭連接完成之后添加。

·除常規的動(dòng)植物總RNA外，其他類(lèi)型的總RNA是否可以作為起始模板進(jìn)行文庫構建？

除動(dòng)、植物總RNA以及分離純化的Small RNA外，Vazyme ＃NR811可以兼容其他類(lèi)型的總RNA，比如外泌體總RNA作為起始模板。下圖為以HeLa細胞培養物上清的外泌體總RNA為模板構建的miRNA文庫（起始模板投入80ng）。

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