ATAC-Seq 實(shí)驗操作指南---01 ATAC-Seq 原理介紹

01 ATAC-seq 原理介紹

染色體結構

人類(lèi)基因組DNA直線(xiàn)長(cháng)度接近2m，而細胞的平均直徑一般在幾十微米，要保證DNA的復制和基因表達調控能夠準確、高效的進(jìn)行，需要將細胞核中的DNA經(jīng)過(guò)多個(gè)水平高度有序的包裝。

2個(gè)H3-H4二聚體和2個(gè)H2A-H2B二聚體形成約11nm的組蛋白八聚體，DNA纏繞其上形成核小體，每個(gè)核小體上大約含有146bp的DNA，核小體相互串聯(lián)成為30nm水平纖絲染色質(zhì)。細胞周期的不同時(shí)期，染色質(zhì)濃縮程度不同，在分裂間期，染色質(zhì)相對松散，具有轉錄活性的同時(shí)DNA暴露區域也可被特定的核酸酶接近并切割，而在分裂期，染色質(zhì)進(jìn)一步包裝為結構緊密的染色體狀態(tài)，此時(shí)呈現出轉錄惰性。

染色質(zhì)可接近性概念

染色質(zhì)分為常染色質(zhì)和異染色質(zhì)，在結構上常染色質(zhì)折疊壓縮程度低，處于伸展狀態(tài)。DNA復制、基因轉錄時(shí)，DNA的致密高級結構變?yōu)樗缮顟B(tài)，這部分打開(kāi)的染色質(zhì)，稱(chēng)之為開(kāi)放染色質(zhì)（open chromatin）。染色質(zhì)一旦被打開(kāi)，就允許一些調控蛋白，比如轉錄因子和輔因子與之相結合，染色質(zhì)的這一特性，就叫做染色質(zhì)可接近性（chromatin accessibility）。這一特性反映了染色質(zhì)轉錄活躍程度。特定條件下的染色質(zhì)開(kāi)放性變化可以提供大量的基因表達調控信息。

 Nature Reviews Genetics, 2014, 15(4):272.

  圖2：染色質(zhì)的可接近性轉換

轉錄因子及基因表達調控

真核生物轉錄調控過(guò)程是大量的順式作用元件與反式作用因子相互作用的結果，具有調控功能的反式作用因子通過(guò)結合染色質(zhì)開(kāi)放區域調控真核細胞基因的表達。轉錄因子識別并結合起始位點(diǎn)上游序列，如GC Box、CAAT Box和TATA Box等順式作用元件，從而啟動(dòng)基因的開(kāi)放表達。遠端調控的增強子，沉默子、絕緣子同樣也可以通過(guò)結合順式作用元件參與調控基因表達的開(kāi)放和關(guān)閉。轉錄因子與基因組結合時(shí)，取代了核小體的位置，暴露出DNA，使其對酶的切割更為敏感。在此基礎上，利用染色質(zhì)對DNase的敏感性，鑒定活化的調控序列?；虮磉_調控是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，在轉錄和翻譯中，染色體三維結構也會(huì )處于動(dòng)態(tài)變化中。 

全基因組染色質(zhì)可接近性研究       

目前染色質(zhì)可接近性的研究方法主要通過(guò)酶解或者化學(xué)方法來(lái)分離可接近區域或者受保護區域的DNA序列，然后再經(jīng)過(guò)高通量測序分析。轉座酶引入高通量測序之前，基因組范圍內染色質(zhì)可接近性的研究方法主要包括 MNase-seq，DNase-seq和FAIRE-seq，這些方法可以幫助我們在大量的細胞系和組織樣本中鑒定出轉錄因子的結合位點(diǎn)、轉錄活性開(kāi)始的位置、核小體和核小體修飾、增強子和絕緣子等。

MNase-seq：微球菌核酸酶（Micrococcal nuclease，MNase）是一種限制性外切酶，進(jìn)行片段化處理時(shí)，將DNA切成缺口后，逐個(gè)切除寡核苷酸，直到獲得被核小體包裹或者被轉錄因子綁定的區域為止。目前MNase消化法和二代測序聯(lián)合使用，通過(guò)定性和定量的方式來(lái)識別基因組范圍內的平均核小體占據率、定位以及染色質(zhì)開(kāi)放區域。

                                    圖4：MNase-Seq原理圖

DNase-seq：基因活躍表達時(shí)啟動(dòng)區域部分序列可能解旋成單鏈，從而不能繼續纏繞在核小體上，使啟動(dòng)區DNA裸露在組蛋白表面，形成對DNaseI的超敏現象。容易被DNase｜切割的位點(diǎn)稱(chēng)為超敏感位點(diǎn)。這些位點(diǎn)是調控元件如啟動(dòng)子、增強子、絕緣子和轉錄因子等的結合位點(diǎn)。DNase-seq技術(shù)與MNase-seq技術(shù)互補，利用DNase｜優(yōu)先切割超敏感位點(diǎn)然后對生成的片段進(jìn)行測序。該方法可用于檢測特定轉錄因子等結合位點(diǎn)。

FAIRE-seq： FAIRE （Formaldehyde Assisted Isolation of Regulatory Elements）甲醛輔助分離調控元件，是借助有機溶劑甲醛對染色體中裸露的DNA 進(jìn)行固定，通過(guò)細胞裂解與超聲打斷再進(jìn)行CHCL3抽提獲取水相中的DNA，在CHCL3抽提的過(guò)程中，蛋白未交聯(lián)的DNA溶于水相中，而蛋白結合型的DNA留在兩相界面，實(shí)驗準備時(shí)間3-4天。將FAIRE-seq與ChIP-seq、DNase-seq聯(lián)用可以用于揭示轉錄因子結合位點(diǎn)、核小體位置分布、染色質(zhì)開(kāi)放區域以及三者之間的關(guān)系。

這些研究染色質(zhì)開(kāi)放區域、核小體定位、轉錄因子占位或者染色質(zhì)生物學(xué)“狀態(tài)"的注釋方法都涉及多個(gè)試驗流程，操作復雜，需要大量細胞作為研究樣本，并且樣本準備過(guò)程非常繁瑣。

為了解決這些問(wèn)題，2013年Standford 大學(xué) William Greenleaf 實(shí)驗室的Buenrostro等發(fā)布了一項整合的、多維的遺傳學(xué)分析方法-ATAC-seq，這種方法通過(guò)Tn5轉座酶將測序的adapters插入到基因組上的“可接近"區域來(lái)標記調控區域。

ATAC-seq

ATAC-seq 全稱(chēng) Assay for Transposase Accessible Chromatin with high-throughput sequencing，是利用轉座酶研究染色質(zhì)可接近性的高通量測序技術(shù)。其原理是利用轉座酶Tn5可切割開(kāi)放染色質(zhì)區域的特性，對Tn5酶捕獲到的DNA序列進(jìn)行測序。DNA轉座，是把DNA序列從染色體的一個(gè)區域搬運到另外一個(gè)區域的現象，由DNA轉座酶來(lái)實(shí)現。只要人為地將攜帶已知DNA序列標簽的轉座復合物（即下圖中帶紅／藍色序列標簽的轉座酶Tn5復合物）與細胞核一起孵育，再利用帶P5、P7以及index的引物進(jìn)行PCR擴增即可形成文庫，經(jīng)過(guò)測序就可以得到開(kāi)放染色質(zhì)的區域信息。

ATAC-seq 可低至20個(gè)細胞便能快速的獲取調控的多維信息，更加適用于珍貴稀少的樣本，且ATAC-seq無(wú)片段選擇性，所以這種方法可以同時(shí)獲得“開(kāi)放"染色質(zhì)的位置、轉錄因子的結合位點(diǎn)、核小體的調控區域和染色質(zhì)狀態(tài)等信息。

相對于其他三種染色質(zhì)開(kāi)放區域研究，ATAC-seq經(jīng)過(guò)一次實(shí)驗，能夠獲得染色體在某個(gè)特定時(shí)空條件下所有開(kāi)放染色質(zhì)區域，并不僅僅局限于某個(gè)轉錄因子的結合位點(diǎn)，或者某個(gè)特定的組蛋白乙?；瘏^域。

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